Nature Communications 棉纖維啓動和(hé)早‌" 期發育的(de)時(shí)空(kōng)轉錄組和(hé)代謝(xiè)組景觀<✘£₩

Spatiotemporal transcriptome and metab§ ∑olome landscapes of ₩€₹→cotton fiber during initiation and ea↑ ♠rly development

Xuwu Sun , Aizhi Qin, Xingxing W∏>×ang, Xiaoyang Ge, Zhixin Li§★÷u, Chenxi Guo, Xiaole Yu,®φ Xianliang Zhang, Yao Lu, J÷♥incheng Yang, Jiuming He, Yaping Zhou,‍✔↕£ Yumeng Liu, Mengke Huδ₽, Hao Liu, Zihao Zhao, Guanjing Hλ✔→u, Wei Li, Xinshan Zang★‌★©, Shuai Dai, Susu Sun, Lenin Yong-V±® ®illalobos,  Luiλ≠s Herrera-Estrella , &n &bsp;Lam-Son Phan Tran & Xioδσ ngfeng Ma

發表期刊：Nature Communications

影(yǐng)響因子(zǐ)：15.7

DOI: 10.1038/s41467-025-55869-z

研究背景：

棉花(huā)作(zuò)為(wèi)全球重要(yào)經濟作(zuò)物(≠☆wù)，其纖維發育經曆起始、伸長(cháng)、加厚和(hé)§§Ωδ成熟四階段，受轉錄因子(zǐ)、激素及代謝(xiè)物(®>wù)協同調控，調控纖維細胞發育的(de)過程已被廣泛研究，然而，在纖維發育的≥₩∏✔(de)早期階段的(de)時(shí)空(♣©'&kōng)轉錄組和(hé)代謝(xiè)組仍然在很(hěn)大(dà)程度上(↑♥shàng)未知(zhī)。本研究創新性整合空(kōng)間(jiānα₹¥)轉錄組（ST）、單細胞轉錄組（scRNA-seq）和(hé)空(kōng)間(jiān)代謝(xiè₽←&£)組（SM）技(jì)術(shù)，系統分(fēn)§★♠析棉花(huā)纖維細胞發育早期階段的(d∏ §e)轉錄組和(hé)代謝(xiè)組的(de)動态變化∑☆♥≤(huà)，鑒定關鍵調控基因（如(rú)GhBEE3）及代謝(xiè)物(wù)，并通(tōng)過功能(néng)實驗驗證其βα‌作(zuò)用(yòng)。研究成果不(bù)僅深化(huà)了(le)對(π duì)棉花(huā)纖維發育機(jī)™♣β制(zhì)的(de)理(lǐ)解，更為(w✔∞èi)作(zuò)物(wù)多(duō)組學研究提供了(lφ≠e)方法論範例。

技(jì)術(shù)方法：空(kōng)間(jiān)轉錄組學、空(kōng)間(ji₹<₽ān)代謝(xiè)組學、單細胞轉錄組學、空(kōng)氣動力輔助解吸電(β<≈₽diàn)噴霧質譜成像（AFADESI-MSI）、液相(xiàng)色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）、mRNA原位雜(zá)交技(jì)術(shù)

研究亮(liàng)點：

1、整合空(kōng)間(jiān)轉錄組、單細胞轉錄組±<、空(kōng)間(jiān)代謝(xiè)組鑒定了(le)可(kě)₹₩能(néng)調控纖維細胞早期發育的(de)關鍵基因（如(rú)DOX2/KCS19.4、BEE3和(hé)HOS3.7）和(hé)代謝(xiè)物(wù)（如(rú)亞油酸、精胺、亞精胺和(δ₩hé)α-亞麻酸）；

2、發現(xiàn)GhBEE3在纖維細胞起始中起重要(yào)作(zuò)用(α↓↓yòng)，過表達GhBEE3促進纖維細胞的(de)起始和(hé)伸長(cháng↑↔£×)，而RNAi抑制(zhì)則減少(shǎo)纖維細胞的(de)數(shù)量；

3、創建了(le)交互式網站(zhàn)（σ∞https://cotton.cricaas.com.cn/ovule/）用(yòng)于可(kě)視(shì)化(huà)棉花(huā)♦₹¶纖維細胞的(de)時(shí)空(kōng)基因表達模式。

研究思路(lù)：

研究采用(yòng)統一(yī)空(kōn∞ g)間(jiān)分(fēn)辨率的(de)多(duō)組學策略，将空±γ(kōng)間(jiān)轉錄組（ST）、單細胞轉錄組（scRNA-≠±seq）和(hé)AFADESI空(kōng)間(ji®÷ān)代謝(xiè)組（SM）相(xiàng)結合。選取−1.5至÷>®↔5-DPA 的(de)棉鈴和(hé)胚珠↔$λ為(wèi)材料，ST繪制(zhì)全組織基因表達地​α₽(dì)圖并鑒定标記基因，scRNA-se∑×σq解析細胞類型及發育軌迹，SM描繪代謝(xiè)←×物(wù)空(kōng)間(jiān)分(fēn)布并'¥篩選關鍵代謝(xiè)物(wù)。随後，将基₹ ≥因與代謝(xiè)物(wù)數(shù)據按代謝(xiè)通(tō  ng)路(lù)整合分(fēn)析，識别在特定細胞和( ✘≥hé)階段共同高(gāo)表達的(de)調控因子(zǐ)。'©÷最後，通(tōng)過原位雜(zá)交驗證空(kōng£✔)間(jiān)轉錄組結果，并對(duì)代表性基因開(kāi)展功↓±π能(néng)驗證，構建棉花(huā)纖維早期發育的(de)多(duō)組γ₹☆學時(shí)空(kōng)圖譜。

圖1 棉花(huā)纖維發育圖譜的(de)分(fēn)子(zǐ®∑)研究方法

研究結果：

1.棉鈴的(de)空(kōng)間(jiān)轉錄♠α組檢測分(fēn)析

研究利用(yòng)ST技(jì)術(sh‍παù)對(duì)−1.5-DPA至5-DPA的(dβ↔←✘e)棉鈴樣本進行(xíng)測序，涵蓋6個(gè)€→→發育階段，并在0 DPA與5 DPA設置∑♦生(shēng)物(wù)重複，共8個(gè)樣本。HE染色結果顯示♥♥，棉纖維細胞在0-DPA開(kāi)始分(fēn)化(huà)，3-DPA時Ω≠γ∞(shí)自(zì)外(wài)種皮伸出，5-DPA進一γ•λ (yī)步伸長(cháng)（圖2a）。經組織優化(huà >π)實驗确定最佳滲透條件(jiàn)為(w≈ $☆èi)24分(fēn)鐘(zhōng)，并在此條件(jiàn)下(xià)≤§完成反轉錄、建庫和(hé)測序，獲得(de)約5萬基因的(de)時(shí)空β✔♠(kōng)表達譜，每個(gè)像素點捕獲1–10個(★δgè)細胞，每個(gè)點含有(yǒu)3177–555♥®6個(gè)表達基因和(hé)極少(shǎo)≥‌數(shù)線粒體(tǐ)基因（線粒體(tǐ)基因主要(yà¶×"o)來(lái)源于細胞核線粒體(tǐ)RNA，主要(yàoγ₩)在細胞代謝(xiè)活躍或死亡時(shí)會(huì)上∏<♣ (shàng)升，可(kě)用(yòng)來(l×¥&ái)評估細胞的(de)活性和(hé)組織完整性）。σ¶↔≠UMAP分(fēn)析将6個(gè)樣本劃分(fēn)為(wèi<↑$)19個(gè)細胞簇（圖2b），并映射回↑¥✔¥組織切片定位，發現(xiàn)“中皮/隔膜細胞”簇（1、2、6、9、Ω≥§≥14）廣泛存在于各階段，而“纖維細胞”簇（3、10、19）特異存在于3 DP$β÷A和(hé)5 DPA（圖2c）。差異表達αγσ≤分(fēn)析鑒定出各簇的(de)标記基因，如(rú)外(wài)種皮簇的(d∏♦λ∑e)SBT4.14、GH3.6.2、GASA14.1，以及纖維細胞簇的(dαδ•e)KCS19.4、HOS3.7、bZIP43.11。GO富集結果₩←¥✔顯示，外(wài)種皮簇與“果實發育”和(hé)“種子(zǐ)發育”≈÷•相(xiàng)關，內(nèi)種皮簇與“氮化(hu←¥δ¶à)合物(wù)生(shēng)物(wù)合成”相(xià♠∑ng)關，纖維細胞簇則與“種子(zǐ)毛狀體(t↑↔ǐ)分(fēn)化(huà)”相(xiàng)關（☆€♣圖2d、e）。

圖2 棉纖維發育六個(gè)階段的(de)時(shí)空(kōng)基因表≤€Ωα達

2.棉花(huā)胚珠中基因表達的(de)ScRNA-seq分(fēn)析

   作(zuò)者對(duì)−1.5、−1、0及1-DPA四個(gè)發育階段進行(xíng)scRNA-seq測序，共獲得(de)2.97萬餘個(gè)高(gāo)質量細胞，單細胞平均表達基因數(shù)為(wèi≤λ)1022-2501。與對(duì)應時(shí)間(jiān)點的(de)ST數(shù)據進行(xíng)比較，結果顯示兩者高(gāo)βσ度一(yī)緻，驗證了(le)數(shù)據的(de)可ε₩(kě)靠性（圖3a）。UMAP分(fēn)析将細胞劃分(fēn)為(wèi)16個(gè)簇，并結合ST結果進行(xíng)注釋，鑒定出如(rú)OPR2同源基因Gh_A05G105700、YUC10.4同源基因Gh_D08G075000等與激素合成相(xiàng)關的(de)代表性基因（圖3c,d）。GO富集分(fēn)析表明(míng)，“外(wài)珠被♦λ”與“珠心”簇顯著富集脂肪酸合成及胚後發育相(xiàng)φ≈關基因，“外(wài)珠被”部分(fēn)簇則與表皮毛狀體(tǐ)₹×₩分(fēn)化(huà)和(hé)伸長( ≤‌♠cháng)密切相(xiàng)關。進一(yī)步的(de)Monocle拟時(shí)序分(fēn)析重建了(le)細胞發育軌迹，将↕€其分(fēn)為(wèi)5個(gè)狀态、3個(gè)分(fēn)支，其中−1.5-DPA外(wài)珠被細胞集中于早期，0與11-DPA外(wài)珠被細胞集中于晚期，反映了(le)不(bù)同細胞類型在™λγ發育過程中的(de)動态分(fēn)布（圖4a-c）。基因表達趨勢可(kě)歸納為(wèi)三個(gè™δ€♦)模塊：早期高(gāo)表達後下(xià)☆α↑‍降型、逐漸升高(gāo)型及中期達峰型，其中編碼★$×←休克蛋白(bái)（HSP）的(de)基因HSP70.20在中期顯著上(shàng)調，印證其在維持纖維起始與伸長(cháng)'​♦細胞穩态中的(de)關鍵作(zuò)用(yò₩≤  ng)（圖4d）。

圖3 1.5-DPA~1-DPA棉花(huā)胚珠的(de)單細胞轉錄組分(fēn)析

圖4 1.5-DPA~1-DPA所有(yǒu)棉花(huā)胚珠樣品的(de©★)拟時(shí)序分(fēn)析

3.棉鈴的(de)空(kōng)間(jiān)代謝(xiè)組檢測分(₩•fēn)析

為(wèi)深入解析纖維發育的(de)代謝(xiè)機(jī)制(zhì)，←↔作(zuò)者采用(yòng)AFADESI-MSI 技(jì)術(shù)，對(duì)−1.5 至 5 DPA 棉鈴分(fēn)階段進行(xíng)高(gāo)靈敏度、★←廣覆蓋的(de)成像分(fēn)析（圖5a）。研究鑒定了(le)多(duō)個(gè)在棉纖維早期發育過程中起重要(→λyào)作(zuò)用(yòng)的(de)代謝(x↓‌iè)物(wù)，這(zhè)些(xiē)代謝(xiè)物(wù)主要(yàoε‌λ)包括脂肪酸及其衍生(shēng)物(wù)（如(rú)亞油酸、α-亞麻酸）、胺類（如(rú)亞精胺、精胺）、氨基酸、肽類及類似物(wù)（↑‌如(rú)L-精氨酸）。此外(wài)，琥珀酸、膽堿、PA-34:1、PA-34:2、PE-44:10、PE-36:4、PC-33:4等也(yě)在早期發育的(de)胚珠中高(gāo)表達，而在其他‌λ®(tā)組織中的(de)表達相(xiàng)對(duì)較低(dī)（¥♠₽圖5a），這(zhè)些(xiē)特定代謝(xiè)物(wù)主要(yà↓​o)參與了(le)以下(xià)代謝(xiè)途徑：亞油酸代謝(xiè)→"​‌、角質層、木(mù)栓層和(hé)蠟的(d♦←✔​e)生(shēng)物(wù)合成、α-亞麻酸代謝(xiè)、甘油磷脂代謝(xiè)、β-丙氨酸代謝(xiè)、不(bù)飽和(hé)脂肪酸的(de)生(shēng)物¶★≠(wù)合成、谷胱甘肽代謝(xiè)、精氨酸和(hé)脯氨酸代謝(xiè)。<↑通(tōng)過AFADESI-MSI技(jì)術(shù)對(duì)不(bù)同發育階段（從(cóng)-1.5 DPA到(dào)5 DPA）胚珠中這(zhè)些(xiē)特定代謝(xiè)物(wù)σ<® 的(de)積累動态進行(xíng)分(fēn)析（圖5b），發現(xiàn)了(le)一(yī)些(xiē)÷π顯著的(de)變化(huà)趨勢：如(rú)貝亨酸、亞油酸、™™εβPE-44:10、亞精胺、膽堿的(de)表達豐度從(cóng)-1.5 DPA到(dào)5 DPA逐漸減少(shǎo)，表明(míng)這(zhè)些(xiē)代謝(x↑∏±♥iè)物(wù)可(kě)能(néng)與纖維的(de)分(fēn)化(hu•λà)啓動密切相(xiàng)關。相(xiàng)反，α-亞麻酸、組氨酰胺、油酸、PA-34:1的(de)表達豐度從(cóng)-1.5 DPA到(dào)5 DPA逐漸增加，表明(míng)這(zhè)些(xiē)代謝(xiè)物←<™β(wù)可(kě)能(néng)與纖維的(d¶∏ e)早期伸長(cháng)密切相(xiàng)關。進一(yī)步對(duì××™)一(yī)些(xiē)代表性代謝(xiè≠←)物(wù)進行(xíng)了(le)空(kōng)間(ji£ ‌&ān)分(fēn)布特征的(de)成像分(fēn)析（圖5c），二十二烷二酸、亞油酸、α-亞麻酸、油酸的(de)空(kōng)間(jiān)分(fēn)布≠β特征顯示出它們在胚珠不(bù)同區(qū)域的(de)特異性表達模§δ式。例如(rú)，α-亞麻酸在3 DPA和(hé)5 DPA的(de)胚珠中表現(xiàn)出較高(gāo)的(de)表達水(shuǐ$₩)平，這(zhè)與之前的(de)研究結果一(yī)緻，表明(míng)α-亞麻酸在促進棉纖維伸長(cháng)方面起著(zhe®β÷☆)重要(yào)作(zuò)用(yòng)。

圖5 正負離(lí)子(zǐ)模式下(xià)棉ε₩♣胚珠中-1.5-DPA~5-DPA的(de)特異性表達代謝(xiè)物(wù)

4.轉錄組和(hé)代謝(xiè)組數(shù)據的(de)綜合分(fēn)析

作(zuò)者綜合分(fēn)析棉花(huā)早期∑§→纖維的(de) ST 與 SM 數(shù)據，利用(yòng) AFADESI 空(kōng)間(jiān)代謝(xiè)組學在纖維早期發育中₽↑<鑒定出多(duō)種顯著差異代謝(xiè)物(wù)（L-精氨酸、氧戊二酸、L-天冬氨酸、α-亞麻酸、亞油酸、精胺、亞精胺等）。可(kě)視(shì)化(huΩ§±₩à)結果顯示，LCAT4 或 PLA2-ALPHA 在胚珠高(gāo)表達，催化(huà)磷脂酰膽堿生(shēng)成>→ α-亞麻酸；磷脂酰膽堿、α-亞麻酸、13(S)-HPOT 等關鍵代謝(xiè)物(wù)在胚珠異位富集。α-亞麻酸可(kě)轉化(huà)為(wèi)茉莉酸 JA，其相(xiàng)關基因在 3、5-DPA 核細胞與纖維細胞中高(gāo)表達，與胚珠中 α-亞麻酸的(de)高(gāo)積累相(xiàng)一(yī)緻​γ，凸顯其在早期纖維伸長(cháng)中的(de)核心作(zuò)用(≠≠yòng)。ST 分(fēn)析進一(yī)步發現(xià↔★n)，DOX2 在 3-DPA 纖維細胞中高(gāo)表達并參與該代謝(xièγ β)途徑，提示其潛在調控功能(néng)。

圖6 ST中α-亞麻酸代謝(xiè)途徑及代謝(xiè)酶相(xiàngα¥)關基因的(de)綜合分(fēn)析

5.通(tōng)過原位雜(zá)交進行(xí✔σ‍£ng)标記基因的(de)分(fēn)析

通(tōng)過對(duì)棉鈴發育早期的(de)ST分(fēn)析，在外(wài)皮細胞中鑒定出标記基因DOX2、SBT4.14、GH3.6.2和(hé)SWEET15（圖2d）。為(wèi)了(le)驗證聚集細胞簇在ST分(fēn)析中的(de)分(fēn)類可(kě)靠性，作≠↓±↓(zuò)者采用(yòng)ISH方法分(fēn)析了(le)這(zhè)四種被皮細胞标記物(wù)在棉鈴發§®γ©育早期的(de)表達模式。ISH分(fēn)析顯示，DOX2和(hé)SBT4.14在-1-DPA外(wài)皮細胞高(gāo)表達，GH3.6.2強烈表達在0-DPA外(wài)皮細胞，SWEET15在3-DPA外(wài)皮細胞強烈表達（圖7b），這(zhè)與空(kōng)間(jiān)轉∏π₩•錄組組結果一(yī)緻。

圖7 RNA原位雜(zá)交顯示的(de)外(wài)皮細胞标記'©&基因的(de)時(shí)空(kōng)表達模式

6.GhBEE3促進棉纖維細胞的(de)起始

已有(yǒu)研究表明(míng)油菜素內(≈'®✘nèi)酯（BRs）可(kě)促進纖維起始與伸長(cháng)。作(zuò)↔♥ δ者在棉花(huā)胚胎中鑒定到(dào) BR 信号轉導相(xiàng)關基因 GhBEE3 高(gāo)表達，推測其參與早期纖維發育。以中棉 24（ZM24）為(wèi)背景，構建 GhBEE3 過表達（OE）與 RNAi 株系，并在 −1-DPA 至 3 -DPA 棉鈴中觀察纖維發育（T3 代）。SEM 結果顯示，−1-DPA 時(shí)各組均僅有(yǒu)少(sh€☆≠ǎo)量突出的(de)纖維細胞；0-DPA 起，OE株系纖維細胞數(shù)量顯著高(gāo)于對(duì)照(zhào)，而✔§≤ RNAi 株系顯著減少(shǎo)。1- DPA 時(shí)差異進一(yī)步擴大(dà)，至 2–3 DPA，OE 株系纖維細胞伸長(cháng)明(mínγ‍£g)顯且密度更高(gāo)，RNAi 株系則纖維稀疏，提示 GhBEE3 在纖維起始與早期伸長(cháng)中具有(yǒu)促進φ¶×φ作(zuò)用(yòng)。

圖8 GhBEE3正向調控棉纖維的(de)起始作(zuò)用(yòng)

研究結論：

該研究采用(yòng)多(duō)時(shπ✔í)間(jiān)點（DPA）采樣策略，整合空(kōng)間(jiān)代謝(♦"ε xiè)組（AFADESI-MSI）、單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）和(hé)空(kōng)間(jiān)轉錄組（ST）等多(duō)組學技(jì)術(shù)，系統解析了(le)棉花(₩&÷huā)纖維形成與早期伸長(cháng)階段代謝(xiè₽σ∞₩)物(wù)的(de)空(kōng)間(jiān)分(fēn✔‍)布及基因調控特征。研究者成功揭示了(le)此過程中轉錄組與代謝(xiè)≤☆₩$組的(de)時(shí)空(kōng)動↓¥¥♠态。同時(shí)，研究構建了(le)交互式網站(zhàn)展示¶≠ 相(xiàng)關數(shù)據，為(wèi)單細胞水(shuǐ)平研究棉花(ε"huā)纖維發育提供了(le)重要(yào)資源。此外∏₹(wài)，該研究不(bù)僅為(wèi)同行↓γ±(xíng)開(kāi)展類似工(gōng)作(zuò)★☆✔€提供了(le)可(kě)行(xíng)方案，更為(wèi)加速單細胞空(≈'β↓kōng)間(jiān)多(duō)組學技(jì)術(shù)在多(™≈>duō)種作(zuò)物(wù)中的(de)應用(yòng)建立了(le)方法"¶∞論模型。

原文(wén)鏈接：https://doi.org/10.1038/s4146♠∞ ↔7-025-55869-z